怎樣診斷生殖器皰疹

感染的診斷要依據病史、臨牀表現和實驗室檢查結果而定。有不潔性交史，而且在生殖器部位出現皮膚紅斑和原發性水皰，易復發等不難診斷。必要時可作皰液塗片，培養、接種、免疫熒光檢查。血清免疫抗體測定等，均有助於診斷和確定病毒類型。

一、細胞學方法

對皮損刮片做Wright-Gemsa （Tzanck試驗）或Papanicolaou染色，可檢出HSV感染特徵的鉅細胞包函體，但不能區別HSV感染或水痘 — 帶狀皰疹病毒感染，敏感性僅爲病毒分離的60%。

二、培養法

從水皰底部取材做組織培養分離病毒，爲目前較敏感、最特異的檢查方法，需5-10天，因其技術條件要求高，價格昂貴，不能普遍使用。

三、抗體檢測

目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測，如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測HSV-2抗體，具有敏感性，且能區分HSV-1和HSV-2的優點。

四、基因診斷

（一）用PCR分型檢測單純皰疹病毒

PCR是一種敏感性高，特異性強的快速檢測方法，標本中含有1fg HSV-DNA就可以檢出，其在HSV感染的診斷研究中發展較快，且分型檢測HSV是發展的趨勢。

1、標本採集和處理

（1）標本採集

①腦脊液：直接無菌採取患者0.5ml腦脊液標本於無菌試管送檢。如肉眼可見血色，應離心取上清。

②羊水及嬰兒血清： 同上，應避免溶血

③腦組織： 腦組織屍檢、活檢標本， 加1ml PBS標本緩衝液研磨後，待檢。

④眼及皮膚病竈分泌物：用預測（半乾）棉拭子直接取患處分泌物， 置1ml PBS標本緩衝液中送檢。

⑤生殖器（宮頸、陰道、外陰、陰莖）標本：先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢，再用預潮棉拭子用力擦拭患處分泌物，置1ml PBS標本緩衝液中送檢。

（2）標本處理

①預處理：所有液體標本均可直接進行模板製備;可以取100μl標本液，離心5000 r/ min×5min後，去上清，取沉澱物進行模板製備。

②模板製備：a： 蛋白酶K消化裂解法：沉澱物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1 h後，煮沸10 min，離心5000 r/ min×5min，收集上清。 b： 水煮法：沉澱物加100μl蒸餾水，搖均水煮20 min，離心5000 r/ min×5min收集上清。c： 1%Triton X-100裂解法：取採集的標本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ min×5min，收集上清。d： 5%NP-40裂解法：取採集的標本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000 r/ min×5min收集上清。e： 如標本溶血嚴重經上述裂解處理後，再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉澱DNA，加10μl DW溶解待檢。#p#副標題#e#

2、PCR擴增

（1）引物設計。以HSV DNA聚合酶的高保守區爲檢測靶序列以確保特異性。設計3個引物，一個上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二個下游特異性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′　）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分別擴增出HSV-1 469bp DNA片段（1981～2359）、HSV-2 391bp片段（1561～1953）：從二型PCR擴增產物中設計了一個不分型的特異性探針HSVP3 5 ‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘）。

（2）PCR實驗體系。取模板10μl： DNAP5 0.5（0.2μmol/L）：DNAP3-1 0.5μl （0.2μmol/L）：DNAP3-2 0.5μl （0.2μmol/L）：4×dNTP 8μl（4×200μmol/L）：10×dNTP 8μl（4×200μmol/L）;10×緩衝液10μl：DMSO 4μl;加DW 65.5μl; 石蠟油 30μl.。

水煮（96℃～100℃

加TaqDNA聚合酶1μ

72℃

↓

95℃

↓

65℃60s → 72℃

↓　　33個循環

70℃

3.擴增產物的檢測和分析

（1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴增產物20μl加樣品緩衝液4μl混勻後，點樣於2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15～20min，溴化乙錠（EB）染色5min，於紫外燈下觀察結果在溴酚藍後面有一條或二條亮紅帶爲陽性結果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在後，無帶則爲陰性結果。

（2）XhoI酶譜法：取HSV-1型PCR產物50μl加XhoI50U，37℃1h後，置3%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15～20min，可產生46bp片段帶（引物後面）;與正常PCR產物比較，XhoI酶切後的大片段電泳位置前移。

（3）Southern印跡法：PCR產物20μl經電泳分離後，用變性液處理60min，再用中和液處理90 min，轉移至硝酸纖維素膜上：80℃烤膜2 h，42℃預雜交（雜交液中）30 min， 加入32p標記HSVP3探針後，42℃雜交過夜;次日用1%SDS/ PBS pH7.2， 42℃洗15min， 0.5% SDS/PBS pH7.2， 42℃洗15min; 膜置X線暗盒內放射性自顯影12～15h， 顯影爲陽性， 不顯影爲陰性。

（二）套式

套式PCR（nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR）是通過“外側”、“內側”兩對引物，即一對擴增較大DNA片段的“外側”引物和一對位於擴增產物中再擴增小片段的“內側”引物，這樣兩次連續放大可以提高PCR檢測的靈敏度，保證產物的特異性。但該方法不能分型，能100%檢出HSV-1，50%檢出HSV-2，應改進分型檢測HSV，更好地在臨牀應用和基礎研究中推廣應用。

1、標本處理：

（1）標本採集同上

（2）DNA 製備：①腦脊液：取100μlCSF 水煮15min，加入250μl無水乙醇，放-30℃10 min;離心10000g30 min，去上清，30℃乾燥後，加入10μl DW; ②腦組織細胞：取沉澱物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10 min;取上清加入等體積酚一氯仿（V/V），輕搖10 min，離心10000r/ min×10 min;取水相，加入250μl DW溶解。#p#副標題#e#

2、PCR擴增

（1）引物設計：選擇HSV1糖蛋白D基因爲檢測靶基因。

NP-PCR 的引物和探針序列

“外”引物

“內引物”

探針

（2） PCR實驗體系和程序： 反應體積爲50μl;模板10μl;BJHSV1.1 0.5μl（0.2pmol/L）; BJHSV1.2 0.5μl（0.2pmol/L）; 10×緩衝液5μl; 4×dNTP 4μl（4×200mmol/L）;DW 27μl; 石蠟油30μl。循環參數爲95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循環20次， 取其擴增產物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應體系中進行套式擴增， 先95℃變性2min，循環參數爲95℃30s; 55℃30s; 72℃60s; 循環30次後，72℃延伸5 min;。

（3） 擴增產物分析：

① 瓊脂糖凝膠電泳染色法：

取擴增產物10μl點樣於2%瓊脂糖凝膠中， 70V電泳15-20min，溴化乙錠染色5min，於紫外燈下觀察結果，在溴酚蘭後面有一條，或二條亮紅條帶爲陽性結果， HSV-2帶在前，HSV-1帶在後，無帶則爲陰性結果。

② Southern印跡法：

PCR產物20μl 經電泳分離後，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉移至硝酸纖維素膜上，80℃烤膜2h，42℃預雜交（雜交液中）30min，加入32P標記HSV探針後，42℃雜交過夜，次日用1%SDS/PBS pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min;膜置X線暗盒內，放射性自顯影12-15h，顯影爲陽性，不顯影爲陰性。

（三）、聚合酶鏈反應—酶譜法

具有經濟廣泛等特點;不僅能一次性分型檢測HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四種病毒，而且方法本身快速、方便、無放射線損傷，易被實驗室接受。可檢出3個CFU的HSV1，靈敏度高，能檢測出中樞神經系統感染第1dCSF中HSV DNA陽性結果，並可用於藥物治療效果的評價。由於病毒的變異性，會出現酶切點突變丟失現象，從而造成酶切陰性結果。對此可以通過型特異性探針或序列分析解決。

1. 標本處理

（1）標本採集，方法同上。

（2）DNA模板製備：每份標本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用

加入等體積的酚—氯仿（v/v）輕搖10min，離心1000r/min×5min;取水相加入500μl（2.5倍體積）無水乙醇，-20℃過夜沉澱DNA，離心15000r/min×5min，吸去液體，30℃乾燥後，加蒸餾水25μl溶解， 待檢。#p#副標題#e#

2. 引物設計：

P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′

P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′

（1）PCR實驗體系：

反應體積100μl; 模板10μl ; P1 0.5μl（10pmol/L） ，P2 0.5μl（10pmol/L）; 4×dNTP 4μl（4×200mmol/L）; 10×緩衝液10μl， DMSD 5μl， DW 65μl， 循環參數爲94℃60s; 60℃60s; 72℃60s;循環40次72℃延伸4min。

（2）擴增產物檢測與酶切分型

①第一步電泳鑑定： 取10μlPCR產物加4μl樣品緩衝液，加入2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳（5-20min）加EB染色5min後，紫外燈下觀察，可初步鑑定擴增產物大小。

②酶切分析：分別取20μlPCR產物於2個Eppendorf管中，加入50μl無水乙醇，-20℃沉澱DNA，再分別用20μlSmal和BamHI反應緩衝液溶解，加入SmaI或BamHI 50U於相應Eppendorf 管內，37℃作用1h。

③第二步電泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl樣品緩衝液，加到2%瓊脂糖凝膠中，70V電泳，15-20min後， EB染色5min，與同步加入未酶切的PCR產物相對照。 紫外燈下觀察， 結果如下

PCR-EC法檢測四種病毒結果

病毒型號靶片段

HSV2518bp—

CMV589bp不需酶切，第一步電泳就可以區分#p#副標題#e#

（四）用RT-PCR檢測單純皰疹病毒

RNA的聚合酶鏈反應（RNA-PCR），可能通過檢測HSV不同期的RNA，這不僅可診斷HSV感染，而且有利於HSV的潛伏期感染機制的深入研究。

RT-PCR是以RNA爲模板經逆轉錄反應（RT）產生cDNA，再以cDNA爲模板進行PCR擴增以達到檢測目的。因此，RNA-PCR也可稱爲RT-PCR。

1、標本處理：

組織塊細胞總RNA提取，取100mg組織標本，加1ml硫氰酸胍變性液，於勻漿器中，室溫研磨均勻後，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L（pH4.0）NaAc， 1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻， 用力振搖10s， 置冰浴15min。10000g4℃，離心20min，取上清水相（上層DNA、下層DNA和變性蛋白質）加入等體積異丙醇置-20℃1h， 沉澱RNA。離心 15000r/min×10min，棄上清， RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解， 再加0.3ml異丙醇沉澱， -20℃1h， 沉澱RNA. 離心15000r/min×10min， 去上清， 沉澱RNA用75%冷乙醇洗一次， 真空乾燥。。加10μl TE緩衝液（pH7.4）溶解，低溫保存備用。臨用前冰浴溶解。

2、PCR擴增

（1）引物設計： 選擇HSV-1ICPO基因（極早期）爲檢測靶基因。設計2個引物，

P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′

P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以擴增ICPO 中266bp序列。

1個探針：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。

（2）PCR實驗體系： 總反應體積爲50μl，模板10μl （0.25-1.0μg）P1 1μl （20pmol/L）;P2 1μl （20pmol/L）; 4×dNTP 4μl（200μmol/L）; 10×緩衝液5μl; AMV（逆轉錄酶） 2μl （50U）; DW 26μl; 循環參數， 94℃變性2min後 94℃50s，60℃60， 72℃60s，循環40次後72℃延伸5min。

3、擴增產物的鑑定：

（1）瓊脂糖凝膠電泳染色法：取10μl PCR擴增產物加4μl 樣品緩衝液，混勻後加樣2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15-20min，EB染色5min。紫外燈下觀察擴增條帶。

（2）Southern印跡雜交法：用32P標記的特異性探針檢測PCR產物，方法同上。

總之，在HSV感染性疾病的臨牀診斷中，PCR能對前病毒或潛伏期低複製的HSV特異性靶DNA片段進行擴增檢測，遠較DNA探針敏感，並能在血清中抗體出現前就可以檢出。因此，PCR無論是作爲基礎研究手段，還是作爲臨牀檢驗診斷方法，均具有廣闊的前景。

五、病理組織學診斷

細胞內水腫，基底層形成大水皰，病竈周圍有多核鉅細胞浸潤，特別是多核白細胞與淋巴細胞充斥於病竈中間。#p#副標題#e#

1.原發性

（1）潛伏期：爲2～7天，常爲3～5天。

（2）好發部位：男性多發生於龜頭、冠狀溝、尿道口、陰莖體及陰囊。女性好發於外陰、陰道及宮頸。兩性均可見於肛周、大腿及臀部。

（3）皮損形態及演變：患處先有燒灼感，隨即出現多個羣集的紅色斑丘疹，並迅速變成小水皰。皰液起初清亮，以後漸變爲膿性。水皰易破潰，形成糜爛或淺潰瘍，伴明顯疼痛。之後結痂而愈，病程約2～4周。

（4）全身症狀：發病前或發病時可有全身症狀，如發熱、頭痛、全身不適、頸項強直和骶2～4段感覺異常，或有排尿困難和白帶增多。幾乎所有患者均可伴腹股溝淋巴結腫大及壓痛。

2.複發性

約在原發性GH痊癒後1～4個月發生。首次HSV-2感染後1年內近60%的患者復發，第1年內可復發4～6次，以後復發次數減少。eves等發現在生殖器感染者中，HSV-1感染者複發率爲14%，而HSV-2感染者則有60%復發。

複發性GH患者可有上述激發因素，或有前驅症狀，全身症狀較輕，復發部位多在原處，病程也較短，皮損約經10天左右即消退。由於病損反覆發作，難以控制，患者易出現精神負擔和性功能障礙，甚至發生抑鬱症等。但其損害與原發性者甚爲相似。

3.特殊型

（1）男性同性戀者GH：本病僅次於淋球菌引起的肛門直腸炎。有人從62例有肛門直腸症狀但淋球菌檢查陰性的男性同性戀者中，29%檢出了HSV-2。臨牀表現多爲嚴重的肛門、直腸疼痛，其他症狀爲便祕、肛門內有分泌物、裏急後重和發熱等。部分病人肛周有水皰或潰瘍。

（2）孕婦和新生兒GH：孕婦患GH後，其後果嚴重。對妊娠GH患者HSV-2攜帶者來說，最重要的是傳染給新生兒。當產道內存在HSV-2時，可有40%～60%的新生兒遭受感染，感染嚴重者可致死亡。

在妊娠早期，患GH的孕婦可影響胎兒，導致流產或死胎。新生兒的先天性感染，出生時可出現帶狀分佈的皰疹、癲癇發作、出血傾向與肝脾腫大。如通過產道感染或胎膜早破而發生逆行感染時，輕者出生後數日至數週可無臨牀症狀，早期可僅有吃奶較差、興奮，以後可發生病毒血症或皰疹性腦炎，重者發生播散性HSV感染，可出現高熱、呼吸困難、出血及中樞神經系統病變，預後不良。

因此，妊娠足月患GH者，如時間允許，應每週從陰道及子宮頸取材，檢查有無病毒感染，若細胞學或病毒培養陽性而羊膜尚完整，或破裂後不足6h，建議剖宮產，以避免胎兒經陰道分娩而發生新生兒HSV感染。

HSV-2感染與宮頸癌：有證據表明，生殖器HSV-2感染可能與宮頸癌的發生有關。血清流行病學檢查發現，宮頸癌患者血清中抗HSV-2抗體較對照組婦女明顯增高。Nahmias等發現，GH患者發生宮頸非典型增生者爲對照組的2倍，而發生原位癌者則爲對照組的8倍。近年來研究證明，患侵襲性宮頸癌和癌前期病變的婦女宮頸脫落細胞中，HSV-2抗原陽性率明顯高於對照組，這種HSV-2抗原位於腫瘤細胞的胞質內，提示爲腫瘤細胞表達的病毒抗原。有人發現，宮頸有高度非典型增生、原位癌及鱗狀細胞癌者的活檢組織中，用間接免疫熒光染色可發現其中的HSV-2抗原。應用DNA-RNA原位雜交技術在宮頸癌和癌前期組織中67%可發現HSV-2特異性mRNA。Frenkel等在宮頸癌組織中檢出HSV-2的DNA。還有作者從手術切除後經放射的宮頸癌病變組織中分離出了HSV-2。

HSV-2感染與HIV感染 與其他生殖器潰瘍性疾病一樣，GH增加了HIV感染的危險性。HSV感染是HIV感染的輔助因子。在HIV感染者尤其是HIV感染的同性戀者中，HSV-2感染率更高，且GH的併發症多而嚴重。在AIDS患者中，耐阿昔洛韋（無環鳥苷）的HSV毒株感染多見。

根據病史、症狀和皮膚或黏膜表現，一般不難作出診斷。必要時可進行實驗室檢查，以明確病原體。